[實(shí)際上，這張表只有答案，沒有問題。]

Klentaq1 是 Taq DNA 聚合酶的 Klenow 片段類似物。它是已知的最熱穩(wěn)定的 Taq 形式，它沒有任何外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶，并且其晶體結(jié)構(gòu)是已知的 [4]。

LA PCR 是長(zhǎng)而準(zhǔn)確的 PCR [1]。

根據(jù)美國(guó) 5,436,149，后綴 LA 表示已混入少量校對(duì)酶。

KlentaqLA (KTLA) 或 TaqLA 或 TthLA 是高溫下進(jìn)行長(zhǎng) DNA 延伸的最佳酶，例如引物定向誘變、長(zhǎng) PCR 或高保真 PCR，或用 PCR 產(chǎn)物引發(fā)（大引物）。（這些“酶”實(shí)際上是混合物，美國(guó) 5,436,149，由 Wayne Barnes 發(fā)明，現(xiàn)在由日本 Takara BIO, Inc. 所有）。

- 觀看此空間以了解我在保真度方面的改進(jìn)。

- TaqLA 由 Boehringer-Mannheim 出售為“Expand”，Takara Shuzo 出售為“ExTaq for LA PCR”，Life Technologies 出售為“Elongase”。

- Perkin Elmer 以“Tth XL”出售 TthLA，Clontech 以“Advantage Tth”出售 - Stratagene 的“TaqPlus”和“Taq Extender”也申請(qǐng)了美國(guó) 5,436,149。

“LA 技術(shù)”是將兩種耐熱酶混合在一起以獲得更長(zhǎng)、更準(zhǔn)確（更高保真度）的 DNA 延伸的概念，通常用于 PCR。由 Wayne M. Barnes、美國(guó) 5,436,149 和國(guó)外同行發(fā)明。該現(xiàn)在歸 Takara Shuzo 所有

以下兩種推薦的緩沖液都假定您添加的 dNTP 和它們自己的（等摩爾）鎂。如果您要添加 250 uM 每個(gè) dNTP，請(qǐng)?zhí)砑宇~外的 1 mM 鎂（最終 3.5 mM）以實(shí)現(xiàn)此目的。
我們通過儲(chǔ)備 10 mM 每個(gè) dNTP、40 mM MgCl2（“10/40”）來做到這一點(diǎn)。然后，以下緩沖液將在 1X 時(shí)提供最佳的“過量”鎂。[您可能更愿意在下面添加額外的 10 mM MgCl2，然后添加不含 Mg

的 dNTP。] Tris-HCl 原液由 Trizma Base 和 HCl 制成，濃度為 1 M Tris。然而，在室溫下以 50 mM 在其他普通水中讀取 pH 值。

* Klentaq1、KlentaqLA 和 Taquenase 的 10xKLA 為

* 500 mM Tris-HCl pH 9.2；160 mM 硫酸銨；25 毫米氯化鎂；1% 吐溫 20。

* Taq 和 TaqLA 的 10xTLA 相同，但只有 7.5 mM MgCl2。

* 包括用于高 GC 目標(biāo)和多重 PCR 的最終 1.3 M 甜菜堿。還將加熱步驟減少到 92-93 度。C. [從參考修改。2 & 5]

我們的“基準(zhǔn)強(qiáng)度”Klentaq1、KTLA 和 TAQUENASE 相當(dāng)于 wt Taq 的活性，如果它們用于 2 kb 的擴(kuò)增。也就是說，0.1 ul 正好適合 50 ul 的反應(yīng)大小。（野生型）Taq 的其他供應(yīng)商將此稱為 5 單位/ul；我們稱其為“5 個(gè) 2kb-PCR 單元”/ul。更長(zhǎng)的目標(biāo)需要更多的 Klentaq1，最大為 0.65 ul/50 ul（目標(biāo)大小為 35 kb；需要 KTLA 而不是 Klentaq1）。對(duì)于小于 2 kb 的目標(biāo)，需要更少的 Klentaq1（但 0.1 ul 仍然可以）。

對(duì)于 2 kb 以下的 PCR 目標(biāo)，如果延伸溫度降低到 60 度，則需要 1/2 的酶（TaqLA 或 KlentaqLA）。并且延伸時(shí)間有所增加（即從 5' 到 8' 或 10'）。

Klentaq1 適用于短 PCR、RAPD 等。對(duì)于循環(huán)測(cè)序，它非常出色，但與 Taquenase 相比，它現(xiàn)在是舊技術(shù)。

KlentaqLA 是否在其 PCR 產(chǎn)物上留下鈍端？部分是，部分不是。Klentaq1 確實(shí)添加了額外的 A。然而，要有效地做到這一點(diǎn)，需要一個(gè)額外的最后延長(zhǎng)時(shí)間（20-30 分鐘）?；旌衔镏械男?duì)
酶預(yù)計(jì)會(huì)去除這個(gè)額外的 A。哪一個(gè)獲勝可能取決于您的 PCR 反應(yīng)在完成
循環(huán)后得到的確切處理。可能性是
：4度過夜。
灣。25度吃午飯。
C。68度的咖啡。
d。上述任何一項(xiàng)，然后在 25 度時(shí)打個(gè)電話。
e. 上述以外。
- 我是否完成了上述實(shí)驗(yàn)條件，然后檢查了
DNA 的末端？否。
- 我是否將我的產(chǎn)品克隆到平端載體中？是的，在 T4 DNA 聚合酶的鈍端連接過程中使用 1 mM 六氨合氯化鈷和 1 mM DTT。
- 我檢查過整個(gè)克隆位點(diǎn)的閱讀框嗎？不是通過測(cè)序。
- 我是否曾經(jīng)將 KlentaqLA 制造的閱讀框關(guān)鍵 PCR 產(chǎn)物克隆到 ORF 的鈍端？是的，根據(jù)編碼產(chǎn)物的酶活性，大約一半的克隆似乎沒有問題。
- 我用過 T 向量嗎？不。

我們有數(shù)據(jù)表明 Taquenase 是循環(huán)測(cè)序的最佳酶。它必須與 MnSO4（除了 MgCl2）一起使用以獲得最佳結(jié)果（Barnes，未發(fā)表）。不幸的是，由于和許可問題（見下文），您無法使用它。

1.25 M 甜菜堿（Sigma 編號(hào) B-2629）也是一個(gè)不錯(cuò)的主意，可包含在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中 [Barnes，未發(fā)表]

“Taquenase”(tm)是兩種Taq突變體的組合。突變體 1 是 N 端缺失 Klentaq1（美國(guó) 5,436,149 和其他國(guó)家正在申請(qǐng)中。突變體 2 是由 Stan Tabor [3] 發(fā)現(xiàn)的 F667Y。F667Y 突變?cè)试S ddNTP 減少 100 到 1000 倍才能正常工作。截至 3 月 25 日， 1997 年，這種突變被授予 Tabor & Richardson 并授權(quán)給 Amersham 的美國(guó) 5,614,365 涵蓋。因此，除非我們獲得 Amersham 的許可，否則我們無法提供這種酶，這是意料之中的。

我們認(rèn)為沒有涉及循環(huán)測(cè)序的（由 M. Craxton, MRC Cambridge, England 發(fā)明），也不是雙脫氧測(cè)序（由 Fred Sanger, MRC Cambridge, England 發(fā)明）

。ddNTP 的意思是“雙脫氧 NTPs”或“雙脫氧終止子”。

NTP是指三磷酸核苷，聚合酶的組成部分。它們可以是 ATP、GTP、CTP 或 UTP==TTP。對(duì)于 RNA，有時(shí)為了清楚起見會(huì)添加前綴 r，例如 rCTP。對(duì)于 DNA，通常會(huì)添加前綴 d，例如 dATP。

雙脫氧是指沒有 OH 基團(tuán)的兩個(gè)位置（2' 和 3' 位置）。

Perkin Elmer 最近將其熒光 ddNTP 的價(jià)格（通過降低濃度）提高了 1000 倍。

DYE-ddNTP 的意思是“DYE 終止劑”或 DYE-雙脫氧終止劑，它會(huì)變得很拗口。它們由 ABI 銷售，但它們最初是由 Dupont 發(fā)明的，可從其子公司 NEN 獲得，或即將推出。

DYE 是指熒光標(biāo)記，由測(cè)序儀上的激光束激活。

Klentaq1 是已知的穩(wěn)定的 Taq DNA 聚合酶形式，在 98 或 99 度的加熱步驟中通過 PCR 測(cè)試。Taquenase 保持這種熱穩(wěn)定性。由于 Thermo Sequenase 是含有 7 個(gè)額外氨基酸的 Taquenase，我們相信它也具有這種更高的熱穩(wěn)定性。