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biontex轉(zhuǎn)染常見問(wèn)題解答
先天免疫系統(tǒng)能夠檢測(cè)所謂的“病原體相關(guān)分子模式”（PAMP）。這些包括例如細(xì)胞外源核酸。取決于細(xì)胞類型的“先天免疫系統(tǒng)”有多明顯，它啟動(dòng)針對(duì)假定病原體的防御措施的能力也越大。這導(dǎo)致了K2® 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和后來(lái)的K4® 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的開發(fā)。
使用化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，特定細(xì)胞類型進(jìn)行內(nèi)吞作用和增殖的能力發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因?yàn)橹|(zhì)復(fù)合物/復(fù)合物最初通過(guò)內(nèi)吞作用逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，然后從內(nèi)體中釋放出來(lái)。如果在分裂過(guò)程中核膜在短時(shí)間內(nèi)是可滲透的，則脂質(zhì)復(fù)合物/復(fù)合物或解復(fù)合的 DNA 只能滲透到細(xì)胞核（即克服“核屏障”）。如果這兩個(gè)過(guò)程中的一個(gè)以不完善的形式發(fā)生，即使轉(zhuǎn)染方法的應(yīng)用是最佳的，也可能相應(yīng)地降低轉(zhuǎn)染效率。因此，低增殖或無(wú)增殖的細(xì)胞（如原代細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞）或內(nèi)吞活性低的細(xì)胞（如 Jurkat 細(xì)胞）被認(rèn)為難以轉(zhuǎn)染也就不足為奇了。另一個(gè)關(guān)鍵因素是先天免疫系統(tǒng)，它針對(duì)每種細(xì)胞類型的發(fā)展各不相同。細(xì)胞能夠檢測(cè)外來(lái)核酸并進(jìn)入防御狀態(tài)。具有低發(fā)育先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（例如 HEK293 細(xì)胞）因此易于轉(zhuǎn)染，而具有強(qiáng)發(fā)育免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（例如 Jurkat 細(xì)胞）則難以轉(zhuǎn)染。
一個(gè)加劇的因素是，上面給出的這些現(xiàn)象可能不僅在細(xì)胞類型與細(xì)胞類型之間*不同，而且在同一細(xì)胞類型的不同基因型之間也可能*不同。不同大學(xué)甚至同一機(jī)構(gòu)內(nèi)不同工作組的同名細(xì)胞中可能會(huì)出現(xiàn)不同的行為，也可以在細(xì)胞系的長(zhǎng)期傳代過(guò)程中觀察到。這種復(fù)雜性將協(xié)議參數(shù)從一個(gè)用戶傳輸?shù)搅硪粋€(gè)用戶的選項(xiàng)減少到最小，即使顯然涉及相同的細(xì)胞類型。
不; 每個(gè)轉(zhuǎn)染試劑都有一組特定的屬性，包括：
大腸桿菌的特定組成和比例
每個(gè)分子的特定凈載量和 pH 值
聚集體穩(wěn)定性/脂質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定性
這些不同的特性對(duì)它們與 DNA 和所討論的細(xì)胞類型的相互作用有直接和特定的影響。因此，協(xié)議參數(shù)不能從一種試劑轉(zhuǎn)移到另一種試劑。
不，這是不可能的。每種細(xì)胞類型和每種轉(zhuǎn)染試劑的高度特異性特性之間的相互作用非常復(fù)雜，以致于對(duì)轉(zhuǎn)染效率的預(yù)測(cè)是徒勞的。另一方面，經(jīng)驗(yàn)值表明，例如靜止細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和原代細(xì)胞通常難以轉(zhuǎn)染。但沒(méi)有規(guī)則無(wú)一??例外。
用合成載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染 DNA 的一個(gè)基本原則是，這種材料只能在細(xì)胞分裂過(guò)程中穿透“核屏障”。作為不可避免的結(jié)果，必須遵守以下幾個(gè)方面：
細(xì)胞培養(yǎng)傳代數(shù)不應(yīng)超過(guò) 30 次。每次傳代都會(huì)發(fā)生一定的遺傳分化；這意味著最能抵抗傳代壓力的細(xì)胞將不成比例地增殖。此外，細(xì)胞培養(yǎng)基的成分會(huì)改變細(xì)胞的生理狀態(tài)，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)根據(jù)現(xiàn)有的營(yíng)養(yǎng)條件調(diào)整自身。這導(dǎo)致與原始細(xì)胞的遺傳差異逐漸擴(kuò)大。
轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞應(yīng)盡可能快地生長(zhǎng)。細(xì)胞應(yīng)保持在高增殖狀態(tài)，稱為對(duì)數(shù)期或指數(shù)期。通過(guò)選擇適合快速增殖的培養(yǎng)基并為要使用的細(xì)胞類型和適當(dāng)?shù)母袷絼?chuàng)建生長(zhǎng)曲線，從而為接種和生長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間設(shè)置最佳細(xì)胞數(shù)量，可以最容易地實(shí)現(xiàn)這一階段。由于生長(zhǎng)抑制，定期保持在匯合條件下的細(xì)胞只有在經(jīng)過(guò)幾次傳代后才能恢復(fù)其全部生長(zhǎng)潛力。
光學(xué)匯合與實(shí)際匯合不同。上面的生長(zhǎng)曲線表示目視確定的匯合（覆蓋整個(gè)生長(zhǎng)表面）對(duì)應(yīng)于實(shí)際匯合（生長(zhǎng)曲線的第 5 階段）的程度。這兩個(gè)匯合值通常有顯著差異。以圖中所示的 COS7 細(xì)胞為例，很明顯，在最常見的情況下，僅實(shí)現(xiàn)了早期生長(zhǎng)期 3。出于這個(gè)原因，如果要在貼壁細(xì)胞上執(zhí)行該過(guò)程，作為規(guī)則，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天應(yīng)具有約 90% 的視覺(jué)確定的匯合度。
脂質(zhì)復(fù)合物的形態(tài)一方面與陽(yáng)離子脂質(zhì)的類型和所用轉(zhuǎn)染試劑的脂質(zhì)組成密切相關(guān)，另一方面與遺傳物質(zhì)與轉(zhuǎn)染試劑的比例密切相關(guān)。每種細(xì)胞類型都顯示出特定的轉(zhuǎn)染能力，具體取決于產(chǎn)生的脂質(zhì)復(fù)合物形態(tài)
?？梢酝ㄟ^(guò)應(yīng)用優(yōu)化過(guò)程確定以下最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)：
首先必須確定 DNA/RNA 與脂質(zhì)的最佳比例。通常認(rèn)為，脂質(zhì)復(fù)合物需要凈正電荷才能與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面靜電相互作用，以實(shí)現(xiàn)成功的內(nèi)吞吸收。在大多數(shù)情況下，這個(gè)比例大約為 1-7µl 脂質(zhì)對(duì) 1µg DNA/RNA。
第二個(gè)關(guān)鍵因素是每個(gè)細(xì)胞的 lipoplex 量；如果這太高，產(chǎn)生的毒性會(huì)過(guò)度補(bǔ)償轉(zhuǎn)染的成功。因此應(yīng)改變脂質(zhì)復(fù)合物的量以反映已知的 DNA/RNA 與脂質(zhì)的最佳比例。
陽(yáng)離子脂質(zhì)能夠擴(kuò)散到細(xì)胞膜中并使其不穩(wěn)定。隨著脂質(zhì)復(fù)合物中脂質(zhì)含量的增加，這可能是毒性增加的主要原因。出于這個(gè)原因，與 DNA/RNA 量相關(guān)的高水平脂質(zhì)只能在有限的范圍內(nèi)使用。
由于未知的原因，脂質(zhì)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性影響比轉(zhuǎn)染試劑本身要大得多。
必須假設(shè)先天免疫系統(tǒng)在檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的外來(lái)核酸后觸發(fā)細(xì)胞凋亡，這很難與毒性相區(qū)分。
這導(dǎo)致了第二個(gè)限制：過(guò)多的 lipoplex 水平會(huì)損害轉(zhuǎn)染成功。毒性的另一個(gè)原因可能是通過(guò)表達(dá)或抑制的蛋白質(zhì)本身進(jìn)行所需的細(xì)胞操作，這可能對(duì)細(xì)胞生理學(xué)產(chǎn)生重大影響。在這種情況下，最佳轉(zhuǎn)染可能會(huì)導(dǎo)致高細(xì)胞死亡率，這只能通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)染效率來(lái)避免。
細(xì)胞培養(yǎng)中使用的血清（例如 FCS、FBS）是一種高度復(fù)雜的不確定混合物，由水溶性血液成分（如生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）組成，并且總是對(duì)轉(zhuǎn)染成功有重大影響。
血清具有廣泛的脂質(zhì)復(fù)合物抑制特性。因此，在脂質(zhì)復(fù)合物形成（結(jié)合轉(zhuǎn)染試劑和遺傳物質(zhì)）期間不得存在血清。
用這些轉(zhuǎn)染試劑形成的脂質(zhì)復(fù)合物可以與含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基一起添加到細(xì)胞中，而不會(huì)影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。事實(shí)上，當(dāng)存在血清時(shí)，這些試劑會(huì)定期提供更高水平的轉(zhuǎn)染效率。
血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)行為。其成分，如生長(zhǎng)激素，可顯著促進(jìn)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂率，從而顯著提高轉(zhuǎn)染效率。在選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)考慮細(xì)胞的增殖行為。如果存在多種可能性，則應(yīng)選擇細(xì)胞增殖率最高的培養(yǎng)基。
由于血清的保質(zhì)期極其有限（最長(zhǎng) 1 個(gè)月），應(yīng)注意所用血清在有效期內(nèi)，因?yàn)槭褂眠^(guò)期血清會(huì)顯著損害細(xì)胞所需的成分。在這種情況下，細(xì)胞顯示出*不同和減少的生長(zhǎng)模式（見圖），并且無(wú)法再預(yù)期最佳轉(zhuǎn)染結(jié)果。
血清的質(zhì)量可能因批次而異。如果所有其他參數(shù)保持不變，成分的多樣性會(huì)導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)染結(jié)果。
是的，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)物的任何污染，無(wú)論是真菌、病毒還是細(xì)菌，都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果產(chǎn)生重大影響，通常會(huì)導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物死亡。由于支原體污染具有不可見且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的特殊特性，因此污染可能會(huì)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)。然而，這些細(xì)菌對(duì)轉(zhuǎn)染成功有廣泛的影響：
由于精氨酸需求增加，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著降低（見圖）
支原體被先天免疫系統(tǒng)識(shí)別并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生
支原體引起染色體畸變
支原體滯留在細(xì)胞膜中并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞膜過(guò)程，如內(nèi)吞作用。
有和無(wú)支原體污染的 HeLa 細(xì)胞的不同細(xì)胞生長(zhǎng)：
支原體污染對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響：
在 48 孔板上用 pCMVßgal 轉(zhuǎn)染 HeLa 和 HepG2 細(xì)胞。通過(guò) ONPG 和 BCA 分析評(píng)估比吸收值。下圖顯示了支原體污染對(duì) HeLa 和 HepG2 細(xì)胞的廣泛影響（未污染細(xì)胞效率的 17% 和 5.6%）：
支原體可以在幾乎所有已知的細(xì)胞類型中增殖，因此無(wú)處不在。據(jù)估計(jì)，大約 80% 的日本細(xì)胞培養(yǎng)物、65% 的阿根廷細(xì)胞培養(yǎng)物和 15% 的美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染。主要來(lái)源是實(shí)驗(yàn)室工作人員以及胰蛋白酶和血清，它們是從動(dòng)物來(lái)源分離的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。
一種長(zhǎng)期存在的支原體檢測(cè)方法是 DAPI 染色。然而，由于其極低的檢測(cè)靈敏度，該方法僅顯示出顯著水平的污染。PCR 方法明顯更靈敏，因此是檢測(cè)方法。Biontex 提供基于 PCR 的檢測(cè)試劑盒MycoSPY®和MycoSPY® Master Mix，它們甚至可以識(shí)別支原體基因組的單個(gè)拷貝。如果細(xì)胞培養(yǎng)物受到污染，我們建議使用MycoRAZOR®進(jìn)行處理。
基本上，具有更高純度的遺傳材料將始終提供更好的轉(zhuǎn)染結(jié)果。需要特別注意的一個(gè)因素是被稱為內(nèi)毒素的脂多糖污染。它們?cè)谥圃爝^(guò)程中由細(xì)菌引入，即使以微量存在，也會(huì)被先天免疫系統(tǒng)檢測(cè)到，從而顯著損害轉(zhuǎn)染過(guò)程。應(yīng)注意遺傳材料的清潔包括去除內(nèi)毒素，可提供商業(yè)試劑盒。不建議將基于“小量制備方案”的質(zhì)粒清洗用于轉(zhuǎn)染目的，因?yàn)檫z傳物質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)直接影響轉(zhuǎn)染成功：
由于啟動(dòng)子具有特定的表達(dá)率，因此細(xì)胞具有特征量或每單位時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物量。
根據(jù)細(xì)胞類型，待表達(dá)基因或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特定特征可能顯著影響細(xì)胞的生理學(xué)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
遺傳物質(zhì)的尺寸和三級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)影響潛在的轉(zhuǎn)染成功。一般來(lái)說(shuō)，以下原則適用：
細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力隨遺傳物質(zhì)的量而下降
超螺旋質(zhì)粒在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中更有效，而線性 DNA 更適合于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
Lipoplexes 粘附在細(xì)胞培養(yǎng)容器的自由塑料表面上，因此在轉(zhuǎn)染過(guò)程中丟失。這就是為什么不能簡(jiǎn)單地將針對(duì)特定容器格式確定的最佳參數(shù)與其他容器格式成比例地應(yīng)用的原因。
使用的容器規(guī)格越小，lipoplex 的量/mm² 就必須越高。當(dāng)從 6 孔培養(yǎng)皿縮小到 96 孔格式時(shí)，必須使用大約三倍于 lipoplex / cm² 的量才能實(shí)現(xiàn)可比的轉(zhuǎn)染效率。
不。鑒于常見問(wèn)題解答中給出的大量參數(shù)是成功轉(zhuǎn)染的影響因素，很明顯，提供通用的特定協(xié)議是徒勞的。我們網(wǎng)站上列出的已發(fā)表案例研究只能說(shuō)明如何盡快實(shí)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)染，一般不能聲稱具有普遍適用性。最后可能需要在自己的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行優(yōu)化。
在室溫或 4°C 下長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間，脂質(zhì)體制劑往往會(huì)凝結(jié)。這意味著大小分布向更大的脂質(zhì)體移動(dòng)，這可能對(duì)轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生負(fù)面影響。冷凍和解凍脂質(zhì)是一種已知的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，因此也可用于為某些轉(zhuǎn)染試劑重建理想的脂質(zhì)體大小分布。
為此目的，該試劑在冰箱中冷凍，然后在室溫下解凍。軟渦旋后，試劑再次儲(chǔ)存在 4°C。建議在使用 METAFECTENE 轉(zhuǎn)染試劑系列（METAFECTENE®、METAFECTENE® PRO、METAFECTENE® SI）和K2® 轉(zhuǎn)染試劑/ K4® 轉(zhuǎn)染試劑，兩個(gè)月后。
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