fivephoton hBACE1-ELISA

人 BACE1試劑盒

部件編號(hào)hBACE1-ELISA

ELISA 

僅用于研究。不適用于診斷應(yīng)用。

儲(chǔ)存：4oC，到達(dá)后 6 個(gè)月

安全性：終止液含有酸。避免眼睛和皮膚接觸標(biāo)準(zhǔn)肽濃度：225 pg/mL

分析范圍：5-200 pg/mL 靈敏度：2.5 pg/mL

實(shí)驗(yàn)原理

試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 測(cè)定 BACE1 濃度。將樣品應(yīng)用于預(yù)先包被親和純化的多克隆抗 BACE1 抗體的微量 elisa 微孔中。孵育樣品，然后清洗。加入第二種山羊抗 BACE1-HRP 結(jié)合物抗體，然后孵育并清洗。加入顯色液 A 和 B，導(dǎo)致顏色變?yōu)樗{(lán)色。應(yīng)用終止液終止反應(yīng)，使溶液變?yōu)辄S色。采用與標(biāo)準(zhǔn)肽濃度對(duì)應(yīng)的 450 nm 處的吸光度讀數(shù)測(cè)定樣品中 BACE1 的濃度。

由于 BACE1 是在分泌途徑（包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和質(zhì)膜 1）中加工的跨膜蛋白，其從細(xì)胞中提取和 ELISA 試驗(yàn)中檢測(cè)的主要方法涉及使用非變性去污劑緩沖液通過(guò)細(xì)胞裂解和溶解進(jìn)行制備。還在生物體液（如 CSF 2）中檢測(cè)到 BACE1：根據(jù)您計(jì)劃測(cè)定的組分，按照以下所述制備樣本。請(qǐng)注意，說(shuō)明 7 與膜包埋部分相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

1、顏氏等。等人《生物化學(xué)雜志》2001 年 9 月 28 日；276 (39) :36788-96。電子版 2001 年 7 月 20 日。

2. Zetterberg H 等。Arch Neurol.2008 Aug;65 (8) :1102-7.

樣品制備：以下作為樣品制備的通用指南。研究應(yīng)進(jìn)行部門(mén)內(nèi)文獻(xiàn)分析，以確定制備樣品的宜方法。

1. 血清：室溫下凝固 10-20 min。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。

收集上清液進(jìn)行測(cè)定。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。測(cè)定上清液部分。

2. 血漿：使用適當(dāng)?shù)?EDTA 或肝素作為抗凝劑。使用攪拌棒混合 10-20 min。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清液。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。

3. 尿液：收集于無(wú)菌容器中。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清，如出現(xiàn)沉淀，再次離心。收集上清液進(jìn)行測(cè)定。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清液：分泌成分檢測(cè)：培養(yǎng)液以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清液進(jìn)行測(cè)定。

• 細(xì)胞漿：用 PBS (pH7.2-7.4) 將細(xì)胞懸液稀釋至細(xì)胞濃度為 100 萬(wàn)個(gè)/ml。進(jìn)行反復(fù)凍融循環(huán)，使細(xì)胞膜斷裂并釋放細(xì)胞內(nèi)成分。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。收集上清液進(jìn)行測(cè)定。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心并測(cè)定

上清液。

• 組織（細(xì)胞質(zhì)成分）：切割組織切片并稱重。在 PBS (pH7.2-7.4) 中加入切片。用液氮快速冷凍。將樣品解凍至 2-8 ℃，加入 PBS 并均質(zhì)化。以 2000-3000 rpm 離心 20 min。除去上清液。

7. 細(xì)胞和組織勻漿和裂解物：使用非變性去污劑蛋白提取試劑（例如，F(xiàn)IVEphoton Biochemicals 部件號(hào)ELSP-1）在冰上存在蛋白酶抑制劑的情況下勻漿組織/和裂解細(xì)胞。離心細(xì)胞碎片，并使用上清液進(jìn)行 ELISA 試驗(yàn)。

8. 樣本可在-80 ℃ 下儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融循環(huán)。您可以將樣本等分用于隨后的 ELISA 測(cè)定。

9. 避免含有 SDS 的變性細(xì)胞裂解緩沖液如 RIPA 緩沖液。

表 1. 試劑盒包含的材料。在 4 ℃ 下儲(chǔ)存所有材料

需要但未提供的材料

1. 37oC 培養(yǎng)箱

2. 標(biāo)準(zhǔn)吸光度酶標(biāo)儀

3. 精密移液器和一次性移液器槍頭

4. 去離子水

5. 一次性樣本稀釋管

6. 吸水紙

7. 轉(zhuǎn)移至 ELISA 皿前，用于制備溶液的 96 孔板

8. 96 通道移液管

試驗(yàn)的重要注意事項(xiàng)和準(zhǔn)備

1. 實(shí)驗(yàn)者應(yīng)進(jìn)行初步試驗(yàn)，以確定符合試驗(yàn)范圍的樣品稀釋液。使用本試劑盒測(cè)定范圍內(nèi)的低和高濃度的標(biāo)準(zhǔn)肽，對(duì)您的樣本進(jìn)行初步測(cè)定。用“樣品稀釋劑（表 1，組分 6）”混懸并稀釋實(shí)驗(yàn)樣品，以符合測(cè)定范圍（或者，用含有蛋白質(zhì)阻斷劑（例如 0.25% 酪蛋白）的 PBS 稀釋樣品）?？赡苄枰獙?duì)多個(gè)樣本進(jìn)行系列稀釋，以確定符合測(cè)定范圍的正確樣本濃度。如果需要調(diào)整，濃縮或稀釋實(shí)驗(yàn)樣品。留出足夠的實(shí)驗(yàn)樣品留樣，用于重復(fù)試驗(yàn)。

2. 通過(guò)僅進(jìn)行溶劑對(duì)照，確定溶劑緩沖液是否無(wú)意中與試驗(yàn)發(fā)生交叉反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化。此外，通過(guò)在溶劑中稀釋提供的標(biāo)準(zhǔn)肽，確定溶劑緩沖液中的成分是否抑制測(cè)定反應(yīng)，并進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)。將結(jié)果與樣品稀釋劑中的相同標(biāo)準(zhǔn)肽稀釋液進(jìn)行比較（表 1，組分 6）。為了補(bǔ)救，在

“樣品稀釋劑”（表 1，組分 6）或在另一種溶劑（如 PBS）中制備樣品，以防止意外的實(shí)驗(yàn)讀數(shù)或試驗(yàn)失活。

• 進(jìn)行測(cè)定前，應(yīng)將試劑盒平衡至室溫 30 min。將打開(kāi)的 microelisa 板保存在密封的塑料袋中，4 ℃ 保存。推薦使用多通道移液器同時(shí)點(diǎn)樣。試驗(yàn)期間應(yīng)密封平板。不應(yīng)使微孔干燥。

4. 在單獨(dú)的試管或 96 孔板中制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，而不是在 ELISA 板孔中。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品同時(shí)轉(zhuǎn)移至 ELISA 板中。

5. 建議對(duì)樣本進(jìn)行一式兩份分析，以解決移液錯(cuò)誤。

6. 使用新的加樣槍頭和 ELISA 板密封劑，以避免交叉污染。

7. 請(qǐng)勿混合其他 ELISA 試劑盒中的試劑。

8. 避免 ELISA 板底部和側(cè)面出現(xiàn)指紋、污跡、劃痕、氣泡或液滴。

9. 請(qǐng)注意，未被沖洗掉的樣本中的疊氮化納可能會(huì)抑制產(chǎn)生測(cè)定顏色反應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)。

10. 當(dāng)根據(jù)含量測(cè)定計(jì)算樣品濃度時(shí)，應(yīng)考慮稀釋因子。

11. 如果清洗液在 4 ℃ 下儲(chǔ)存期間結(jié)晶，則在 37 ℃ 下加熱溶液并振搖直至結(jié)晶混懸。

試驗(yàn)程序

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品應(yīng)同時(shí)加入孔中。在單獨(dú)的 96 孔板中制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，并同時(shí)轉(zhuǎn)移至 ELISA 板中。不得在 ELISA 板中制備溶液。

檢測(cè)方法

• 留出 12 個(gè)孔，標(biāo)記用于標(biāo)準(zhǔn)肽稀釋液。如下表 2 所示，一式兩份配置 6 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)肽。切勿直接使用 ELISA 孔進(jìn)行稀釋。各孔的終總體積應(yīng)為 50 l。

表 2. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液該稀釋系列用于 225 pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)肽。

2. 空白、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備：（在單獨(dú)的多孔培養(yǎng)皿中預(yù)混合溶液，并將溶液同時(shí)轉(zhuǎn)移至 ELISA 培養(yǎng)皿中。不得在 ELISA 皿中預(yù)混合溶液）。

a) 空白孔：設(shè)置兩個(gè)“空白孔”：“重現(xiàn)樣品溶劑（不含樣品）相對(duì)于空白溶液中樣品稀釋劑的比例?？瞻兹芤褐噩F(xiàn)了不含抗原的樣品溶液的含量。對(duì)于每個(gè)空白孔，制備 50 μL 混合的“空白溶液”。

b) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液孔：在各稀釋度下制備 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品。

c) 樣品孔：對(duì)于每個(gè)孔，制備 50 μL 樣品（可能已經(jīng)預(yù)先稀釋以滿足測(cè)定范圍）。

d) 同時(shí)將空白、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分配到 ELISA 試紙條中。

e) 立即分配 50 μL HRP 結(jié)合物檢測(cè)抗體溶液（組分 4 表

1) 至各孔。然后用封閉膜覆蓋微孔板。

f) 在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中輕輕混合 30 min。

3. 孵育期間，制備清洗液：用 dH20 將 30 倍清洗液稀釋至 1 倍。每孔制備 600 μL 1X 清洗液。

4. 清洗：小心移除密封件膜：請(qǐng)勿交叉污染液體。輕輕抽吸

去除每個(gè)孔中的液體。翻轉(zhuǎn)平板并在吸水紙上拍干。加入 100 μL 清洗液

溶液并在抽吸前在孔中滲濾 3 min。輕輕旋轉(zhuǎn)酶標(biāo)板。重復(fù)清洗步驟 5 次，清洗 30 秒。因此，每孔總共需要 600 μL 清洗液。也可以使用自動(dòng)清洗器清洗 ELISA 孔。吸干微孔板，但不允許微孔干燥。

5. 顯色：每孔先同時(shí)加顯色液 A 50 μL，再每孔同時(shí)加顯色液 B 50 μL。輕輕混合溶液 A 和 B。將平板在 37 ℃ 下避光孵育 10 min。

6. 終止：每孔加入 50 μL 終止液終止反應(yīng)（藍(lán)色變?yōu)辄S色）。佩戴護(hù)目鏡：終止液含有酸。

• 在加終止液 10 min 內(nèi)，在 450 nm 處讀取樣品：設(shè)空白孔為零，測(cè)定各孔在 450 nm 處的吸光度 (OD)。

數(shù)據(jù)分析

1. 用空白標(biāo)準(zhǔn)溶液和相應(yīng)的 OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可能希望計(jì)算線性回歸方程，以確定您樣本的濃度。請(qǐng)記住，在終計(jì)算中，樣品在試驗(yàn)中稀釋了 5 倍。用于計(jì)算樣品濃度的其他數(shù)據(jù)分析方法也適用。

程序流程圖

制備標(biāo)準(zhǔn)品、空白和樣品

向孔中加入樣品和 HPR 檢測(cè)抗體結(jié)合物，在 37 ℃ 下室溫孵育 30 min。

每孔洗滌 6 次

加入顯色液 A 和 B，37 ℃，10 min，暗處 

加入終止液